Возьмите две раковые клетки и сравните их геномы. Удивительно, но они могут быть совсем разными. Эта генетическая изменчивость – один из отличительных признаков рака и одна из причин, почему лечить рак так сложно.
Если опухоль состоит из клеток с множеством разных геномов, одно лекарство не может убить их все. Но знание генетической изменчивости может помочь врачам разработать целевые методы лечения.
В рамках нашего исследования мы захватили единственную раковую клетку на пластиковом устройстве (см. Рисунок), извлекли ее ДНК и получили грубое изображение ее последовательности. Наши результаты опубликованы в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS).
Оптическое картирование ДНК из одной клетки
Мы использовали метод, называемый оптическим картированием, который предоставляет крупномасштабную информацию о геноме. Он работает как карта мира с лесами, озерами и горами, но без таких мелких деталей, как дороги, дома и небольшие города.
Сравнивая оптические карты одной клетки со справочной картой средней человеческой клетки, мы можем точно определить различия между ними. Эта информация может выявить геномную гетерогенность опухоли и даже указать на то, как клетки превратились в опухоли.
Оптическое картирование ДНК отдельной клетки состоит из четырех этапов:
Мы разработали недорогое пластиковое устройство, объединяющее все четыре этапа. Шаги показаны на рисунке ниже.
Клетки человека загружаются в одноразовое пластиковое устройство. Захватывают одну клетку, экстрагируют ее ДНК и окрашивают флуоресцентным красителем. Затем ДНК нагревают для создания «штрих-кода», т.е.е. образец флуоресценции, который зависит от конкретной последовательности ДНК. Отдельные фрагменты ДНК растягиваются, их штрих-коды отображаются и анализируются. Сравнение с эталонным геномом показывает генетические изменения в конкретной клетке, из которой произошла ДНК.
«Штрих-код» работает как отпечаток пальца: он определяет, с какой частью эталонного генома связана молекула ДНК. И он даже может выявить различия между изображенной молекулой ДНК и эталонным геномом.
Секвенирование против оптического картирования
Так зачем использовать оптическое картирование, а не просто обычное секвенирование ДНК?? Обычные методы секвенирования ДНК имеют то преимущество, что они разрешают одну пару оснований, что означает, что каждая пара оснований в молекуле ДНК может быть идентифицирована. Имея достаточно материала, исследователи могут секвенировать весь геном человеческой клетки – примерно 6 миллиардов оснований – за несколько дней. Но секвенировать единственную копию генома человека сложно. И это все, что у нас есть, когда мы начинаем с одной клетки.
Одна из проблем заключается в том, что обычные методы секвенирования ДНК требуют множества копий генома. Поскольку в каждой клетке есть только одна копия генома, первым делом нужно скопировать геном несколько раз. Это называется амплификацией ДНК и является обычной химией. Но иногда возникают ошибки копирования, которые затемняют результаты.
Еще одна проблема заключается в том, что каждая копия молекулы ДНК случайным образом разрезается на более мелкие части, длиной всего несколько сотен пар оснований. Затем эти пьесы чередуются. Результаты, так называемые «чтения», затем собираются в полный геном путем сопоставления частично перекрывающихся чтений.
Также очень сложно обнаружить структурные вариации, такие как повторяющиеся шаблоны или вставленные / отсутствующие геномные элементы, длина которых превышает длину считывания в несколько сотен пар оснований. Но именно такая структурная информация может оказаться полезной при выборе лечения рака.
По крайней мере теоретически существует более очевидный и эффективный способ считывания последовательности ДНК. Геном закодирован на 48 молекулах ДНК в волокнах толщиной два нанометра и длиной до восьми сантиметров. Так почему бы просто не прочитать последовательность ДНК от одного конца до другого??
Оптическое картирование почти делает это: оно дает приблизительный «отпечаток пальца» лежащей в основе последовательности ДНК молекул ДНК длиной до 1 миллиона пар оснований. Это намного больше, чем короткие длины чтения при секвенировании ДНК. Оптическое картирование также позволяет избежать этапов амплификации, необходимых для секвенирования ДНК.
Длинные фрагменты позволяют обнаруживать структурные вариации от нескольких пар оснований до нескольких сотен пар оснований. Более мелкие вариации могут быть обнаружены с помощью секвенирования ДНК.
Таким образом, два метода (секвенирование и отображение) дополняют друг друга. И одна и та же молекула ДНК, в принципе, может быть как оптически картирована, так и секвенирована.
На пути к более эффективному и индивидуальному лечению рака
Возможность секвенировать геном на уровне одной клетки может привести к более эффективным и индивидуализированным методам лечения рака. Но, как мы объяснили выше, секвенирование ДНК из одной клетки все еще требует использования современных методов секвенирования.
Мы впервые продемонстрировали, что оптическое картирование может обнаруживать крупномасштабные генетические вариации в молекуле ДНК, взятой из одной клетки. И мы делаем это без этапов амплификации, требуемых методами секвенирования ДНК.
Подготовка образцов проводилась полностью на одноразовом устройстве «лаборатория на чипе», начиная с одной клетки и заканчивая полезными данными геномики. Это важный технологический аспект нашей работы, так как устройство сокращает использование дорогостоящих химикатов и сводит к минимуму риск загрязнения.
Чтобы было ясно, наша работа все еще находится на стадии исследования. Наше устройство еще не готово для использования в больницах, и сейчас задача состоит в том, чтобы увеличить пропускную способность, чтобы мы могли анализировать больше молекул ДНК за раз. Цель состоит в том, чтобы отобразить всю ДНК из одной клетки.