Команда исследователей теперь развивала ряд инструментов, чтобы наблюдать, контролировать и определить количество, как misfolded белки, связанные с болезнью Паркинсона, входят в нейроны в лабораторные культуры и что происходит с ними, как только они внутри. Результаты будут изданы в выпуске 11 августа Журнала Биологической Химии.Альфа-synuclein – белок, найденный во всех нейронах, где она, как думают, вовлечена в регулирование выпуска нейромедиатора.
Неправильно свернутая альфа-synuclein склеивается, формируя волокнистые депозиты, названные крахмалистыми волоконцами. Это главные компоненты тел Lewy, массы, замеченные в нейронах больных болезнью Паркинсона.В 2011 группа Вирджинии Ли в Центре Исследования нейродегенеративного заболевания в Университете Пенсильвании показала, что, если бы произведенные лабораторией альфа-synuclein волоконца были добавлены к нейронам, растущим в блюде, нейроны развивали бы тела Lewy и показали бы другие симптомы нейродегенерации.
Это исследование и другие намекнули, что misfolded альфа-synuclein могла распространиться от клетки до клетки, вместо того, чтобы формироваться снова в каждой отдельной клетке. Однако не было никакого способа непосредственно наблюдать начальные шаги альфа-synuclein волоконец, входящих в клетки.
«Наше понимание нейродегенеративного заболевания – или даже нормальная функция здорового мозга, в этом отношении – ограничено методами, которые мы в настоящее время имеем в нашем распоряжении», сказали Ричард Карпович младший, postdoc в лаборатории Ли, которая привела новое исследование.Карпович разработал простой, но чувствительный метод, чтобы визуализировать альфа-synuclein волоконца, входящие в клетки. Во-первых, он культурные нейроны и синтезируемые альфа-synuclein волоконца помечен с флуоресцентными белками.
Затем, он поместил клетки и флуоресцентные волоконца в блюде вместе. Тогда он добавил краску, названную trypan синим, который выключает флуоресцентные признаки. Значительно, эта краска не может пройти через неповрежденные клеточные мембраны, что означает, что она не может выключить признаки, которые уже являются внутренними клетками. Как только он добавил краску, пылающие волоконца за пределами выключенных клеток, но те, которые уже вошли в клетку, продолжали пылать, позволяя ему визуализировать и посчитать усвоенные волоконца.
Кроме того, в сотрудничестве с исследовательской группой Э. Джеймса Петерссона в Отделе Химии в Университете Пенсильвании, исследователи также развивали волоконца, маркированные длительными флуоресцентными признаками, которые были или чувствительны или нечувствительны к кислотности. На основе того, была ли флюоресценция видима, исследователи могли бы определить, когда волоконца вошли в кислые отделения в клетку, позволив им вывести клеточные процессы, которые действовали на волоконца.
Используя эти методы, команда смогла получить несколько понимания судьбы волоконец, входящих в клетки. Они нашли, что волоконца были активно охвачены клеточной мембраной и транспортированы в лизосомы, отделение для вывозов отходов клетки, где большинство волоконец оставалось в течение многих дней. «Удивительно, сколько клетка в состоянии изолировать», сказал Карпович. Но несмотря на максимальные усилия клеток, некоторые волоконца нашли свой выход из лизосом и вызвали скопление белка.Когда исследователи добавили хлорохин к клеткам, чтобы запретить lysosomal деятельность, все больше родной альфы-synuclein было принято на работу, чтобы сформировать совокупности.
Дисфункция Lysosomal часто наблюдается в пациентах с нейродегенеративными заболеваниями. «Мы знаем, что часть из [патологические белки], так или иначе, выходят из лизосом», сказал Ли. «Но мы не знаем, как это происходит».Но способность точно определить сумму поднятых волоконец позволит исследователям быстро показывать потенциальные фармакологические комплексы, которые могли однажды использоваться, чтобы остановить распространение испорченных белков в пациенте. «Как только Вы можете посмотреть [волоконце] на внедрение в клетку и определить количество, сколько в клетке, тогда Вы можете добавить маленькие молекулы к нему, чтобы видеть, можете ли Вы уменьшить внедрение», сказал Ли. «Это – действительно простое испытание и не берет очень долго».
Карпович добавил, что рассмотрение наследственной изменчивости в этих путях внедрения могло обеспечить намеки относительно того, почему некоторые люди более восприимчивы к болезни, чем другие.