Микрофотография метастатических клеток меланомы, слева, которые проникли в ткань поджелудочной железы, справа.
Команда под руководством исследователей из Национального института здоровья является первой, кто систематически исследует геном меланомы, ДНК-код самой смертоносной формы рака кожи. Исследователи сделали удивительные новые открытия, используя секвенирование всего экзома, подход, который декодирует 1-2 процента генома, который содержит гены, кодирующие белок. Исследование опубликовано в раннем онлайн-выпуске журнала Nature Genetics от 15 апреля 2011 г.
Меланома – самая серьезная форма рака кожи, и заболеваемость ею растет быстрее, чем любым другим раком. Считается, что основной причиной является чрезмерное воздействие солнца, особенно ультрафиолетового излучения, которое может повредить ДНК и привести к вызывающим рак генетическим изменениям в клетках кожи.
"Теперь ясно, что геномный анализ будет иметь большое влияние на нашу способность диагностировать и лечить рак," сказал директор Национального института исследования генома человека Эрик Д. Зеленая, M.D., Ph.D. "Это исследование представляет собой сотрудничество фундаментальной науки, клинических исследований, секвенирования генома и анализа данных в лучшем виде."
Исследователи провели всесторонний анализ генома и изучили функциональные компоненты генома меланомы, особенно генные изменения или мутации. Они изучали запущенную болезнь ?? метастатическая стадия ?? когда клетки имеют наибольшее накопление генных мутаций.
"Меланома – одна из самых сложных форм солидного рака, потому что у нее очень высокий уровень мутаций," сказал старший автор Ярдена Сэмюэлс, Ph.D., исследователь в отделении генетики рака отдела внутренних исследований NHGRI. "Секвенирование всего экзома поможет нам выявить наиболее важные изменения."
Исследователи NHGRI и их коллега из Онкологического центра Джонса Хопкинса Киммела в Балтиморе разработали и проанализировали новое исследование, в то время как исследователи Национального института рака (NCI) и коллеги из онкологического центра доктора медицины Андерсона Техасского университета в Хьюстоне и Школы Денверского университета Колорадо. Медицина собрала образцы опухоли меланомы.
"Это исследование является примером жизненно важной полезности сохранения высококачественных образцов опухолей, которые включают клиническую информацию," сказал соавтор исследования Стивен Розенберг, M.D., Ph.D., начальник хирургии в NCI. "Кроме того, это яркий пример важности объединения фундаментальной науки и клинической медицины."
В качестве первого шага в исследовании исследователи NHGRI получили 14 образцов метастатической опухоли меланомы и соответствующие образцы крови из коллекции, хранящейся в NCI. Секвенирование всего экзома 28 образцов было выполнено в Центре интрамурального секвенирования NIH.
Данные последовательности экзома потребовали ряда аналитических шагов, чтобы отделить функционально важные мутации от большого количества общих результатов. Первый из этих анализов позволил дифференцировать мутации, спорадически возникающие в опухоли, называемые соматическими мутациями, от унаследованных мутаций. Это повлекло за собой сравнение между мутациями, наблюдаемыми в образцах крови, и мутациями из опухолевых клеток того же человека. Исследователи исключили из дальнейшего анализа любые опухолевые мутации, которые также произошли в нормальных тканях.
В этом большом наборе соматических мутаций последовательность содержала тысячи мутаций, которые происходят, но, как предполагается, не играют никакой роли в развитии опухоли, называемых мутациями-пассажирами, поскольку они, вероятно, только что появились. Исследователи вычислили коэффициент возникновения мутаций пассажира по сравнению с мутациями водителя, известный как частота фоновых мутаций. Эта статистика различается для каждого типа рака. В своем исследовании авторы предоставляют наиболее полные на сегодняшний день данные об этом аспекте анализа мутаций меланомы.
Исследователи исключили из дальнейшего анализа любые унаследованные генетические изменения, уже аннотированные в таких наборах данных, как база данных Single Nucleotide Polymorphism, или dbSNP, и проект 1,000 Genomes Project. Кроме того, биоинформатический анализ генов, сохраняемых у разных видов, показал, какие мутации заслуживают дополнительного функционального исследования. "Большинство мутаций являются мутациями-пассажирами, что означает, что они не играют функциональной роли в меланоме," Доктор. Сэмюэлс сказал.
Как только пассажирские мутации будут исключены, команда сможет сосредоточиться на тех, которые с наибольшей вероятностью могут вызвать меланому. Исследователи идентифицировали 68 генетических изменений, которые, по-видимому, подвергались соматической мутации с повышенной частотой. Затем они идентифицировали 16 генов, которые считаются драйверными мутациями меланомы, с учетом как частоты фоновых мутаций, так и количества соответствующих мутаций, обнаруженных в опухолях в этом исследовании. Из 16 только онкоген BRAF когда-либо был вовлечен в меланому.
Ген ионотропного рецептора глутамата, GRIN2A, был наиболее сильно мутированным из генов, впервые вовлеченных в меланому. Он содержал мутации в 33 процентах выборки NCI и в 25 процентах большего набора образцов, которые объединили те, которые поддерживаются NCI и двумя другими коллекциями. Исследователи предполагают, что этот ген важен из-за его роли в сигнальном пути. "Есть некоторые признаки того, что это ген-супрессор опухоли," Доктор. Сэмюэлс сказал, "но нам все еще нужно доказать, что с помощью функциональных исследований." Гены-супрессоры опухолей обычно действуют как тормоз, предотвращая неконтролируемый рост клеток, характерный для рака.
Затем исследователи искали повторяющиеся, или горячие точки, мутации, которые произошли в опухолях нескольких пациентов. Ген BRAF с мутацией горячей точки, ранее связанной с меланомой, возглавил список из девяти дополнительных генов с мутациями, которые произошли в более чем одной опухоли. Мутации в семи из девяти генов вызвали изменения кодирования белков. Эти семь мутаций горячих точек побудили исследователей искать именно эти мутации в 153 дополнительных опухолях меланомы.
Мутации в одном конкретном гене, известном как TRRAP, примечательны тем, что происходят в точном положении у шести отдельных людей с меланомой. TRRAP содержит повторяющуюся мутацию, сгруппированную в одной позиции вдоль строки кода ДНК, примерно в 4 процентах случаев.
"Эти данные предполагают, что TRRAP является драйвером и, вероятно, онкогеном," сказал доктор. Сэмюэлс. Онкогены – это гены, вызывающие рак, которые позволяют клетке выживать в стрессовых условиях, а не отмирать обычным образом. "Это было одним из самых важных открытий в исследовании, поскольку мы никогда не ожидали идентифицировать новые мутации горячих точек," она сказала.
TRRAP обнаружен у многих видов, что свидетельствует о его важности для нормального функционирования и о том, что мутации в этом гене пагубно влияют на функцию белка. Чтобы подтвердить возможную функцию выживания клеток для TRRAP, исследователи разрушили ген в мутантных клеточных линиях. С течением времени гибель клеток увеличивалась. Раковые клетки обычно не подвергаются гибели клеток, что позволяет им стать бессмертными и вызывать болезни. Тест показал, что TRRAP является онкогеном, вызывающим рак, потому что мутантная клетка явно зависит от него. Доктор. Сэмюэлс предупредил, что, хотя это открытие является захватывающим, оно остается открытием фундаментальной науки и не обязательно предлагает терапию.
Наконец, исследователи использовали анализ клеточных сигнальных путей, идентифицировав передачу сигналов глутамата как путь, участвующий в меланоме. "Мы начинаем изучать, что мутации делают с глутаматным путем," сказал доктор. Сэмюэлс, отмечая, что текущие исследования повлекут за собой сложную биохимию. Она добавила, что коллеги из NIH опубликовали исследование в выпуске журнала Nature Genetics от 21 апреля 2003 года почти ровно восемь лет назад, в котором говорится о причастности пути передачи сигналов глутамата к меланоме.
"Эта работа демонстрирует, что наши внутренние исследователи находятся на переднем крае геномики и биоинформатики, предоставляя высококачественные данные и анализ для решения важных вопросов о здоровье и болезнях," сказал научный директор NHGRI Дэниел Кастнер, M.D., Ph.D.
В рамках анализа секвенирования исследователи NISC разработали статистический инструмент под названием «Наиболее вероятный генотип». Инструмент рассчитывает надежность данных, полученных в процессе секвенирования. "Эта статья не только о биологии," сказал доктор. Сэмюэлс. "Мы предоставляем эффективный инструмент другим исследователям, которые проводят секвенирование экзома, чтобы они тоже могли проверить, какие изменения ДНК надежно обнаруживаются."